方法

分析流程

数据收集（3 个来源）
  → 预处理（ComBat-seq + TMM 标准化 + 基因过滤）
    → 整合（Scanpy PCA + UMAP）
      → 谱系顺序验证（PAGA 轨迹 + 临床特征）
      → 组织反卷积（TAPE）
      → 差异表达分析（EdgeR）
      → 通路富集（gseapy）
      → 分子验证（qPCR）

纳入/排除标准

三条严格标准：

1. 仅接受人类骨骼肌组织（排除细胞系或类器官）
2. 使用高通量技术进行 Bulk RNA-seq（排除芯片或单细胞数据）
3. 保留原始计数数据格式（排除已转换格式的数据集）

数据来源

来源	样本数	登录号
GTEx	803	dbGaP phs000424.v8.p2
GEO	291	GSE115650、GSE175861、GSE184951、GSE201255、GSE202745、GSE140261
Helsinki	127	本地数据（39 例同时在 GSE151757）

预处理

批次效应校正

• 方法： ComBat-seq（基于负二项回归的批次校正）
• R 包： sva
• 批次变量： 测序平台 — 930 例 mRNA (polyA) vs. 291 例 total RNA (ribosomal)

标准化

• 方法： TMM（M 值修剪均值）通过 conorm
• 比 TPM/FPKM 更适合样本间比较

基因过滤

• 初始基因集：1,221 例样本中 16,953 个候选基因
• 过滤规则：肌肉特异性基因计数在所有样本中必须 > 0
• 最终：选定 9,231 个基因

整合与可视化

• 工具： Scanpy (Python)
• 流程： PCA → UMAP（类单细胞分析方法应用于 bulk 数据）
• 关键发现： 相似表达模式聚集在一起；肌病肌肉呈带状分布而非紧密聚类

谱系顺序验证

计算机模拟验证

• 伪时间分析（PAGA）预测从健康到肌病的肌肉退化转变
• 轨迹预测算法确认疾病严重程度谱系顺序

临床特征映射

将临床特征映射到 UMAP 以验证谱系顺序：

肌病	临床特征	Jonckheere 检验	p 值
CDM	CTG 重复扩增	JT = 181	1.07e-03
LGMD R12	Mercuri 评分 (cMRI)	JT = 459	2.09e-06
LGMD R12	10 米步行测试	JT = 369	0.011
LGMD R12	6 分钟步行测试	JT = 164	0.014
FSHD	脂肪分数 (qMRI)	JT = 139	0.193
FSHD	病理评分	JT = 147	0.36
FSHD	临床严重程度评分	JT = 125	0.753

差异表达分析

• 工具： EdgeR (R)
• 参考： GTEx 真正健康对照（n = 234，意外死亡 + 突然死亡）
• 阈值： |log2FC| > 0.5 且 FDR < 0.05
• 结果： 一般肌病（n = 292）vs. 真正健康（n = 234）：200 个上调和 568 个下调基因

细胞类型反卷积（TAPE）

• 工具： TAPE（基于深度学习的自编码器）
• 参考数据集：
  • Tabula Sapiens（30,746 个细胞）
  • GSE143704（22,058 个细胞）
• 比较： 五个对照组 vs. 肌病组
• 发现： 肌病组血管细胞较少，脂肪细胞和 COL1A+ 成纤维细胞更多

通路富集

• 工具： gseapy (Python)
• 数据库： Human Phenotype Ontology、CellMarker Augmented、KEGG、GO、Reactome、WikiPathway
• 关键通路： 肌肉收缩、脂肪萎缩、肌管细胞参与、FATZ 结合

qPCR 验证

• 组织： Helsinki 下肢肌肉活检（13 例患者 + 6 例对照）
• 方法： RT-qPCR，SYBR Green 法，以 18S 为内参
• 验证基因：
  • 一般肌病：MGST1、AOX1、FASN、PRKCD
  • IBM：CD163
  • Titinopathy：CYP4B1

软件版本

工具	版本	用途
Python	3.8.1	主分析
R	4.2.2	DEG 和统计
Scanpy	—	整合 & UMAP
EdgeR	—	差异表达
ComBat-seq	—	批次校正
TAPE	—	细胞类型反卷积
gseapy	—	通路富集
DescTools	—	Jonckheere 趋势检验
conorm	—	TMM 标准化